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点击次数：3069 发布时间：2022/12/26 12:58:10
试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；
试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加入 40mL 试剂一；
试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加入 2.5mL 试剂二；
标准品：液体 0.5mL×1 支，4℃保存。10μmol/mL 谷氨酸标准品。
Glu 广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是组成蛋白质的 20 种氨基酸，而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成，是生物体内主要氨基来源。此外，Glu 还是味精的主要有效成分，常用做食品添加剂以及香料生产。
谷氨酸脱氢酶 (GDH) 催化谷氨酸和 NAD 生成α-酮戊二酸、NADH 和 NH4+ ，引起 340nm 处吸光度的上升，通过测定 340nm 吸光度的变化，计算谷氨酸含量。
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水。
细菌、细胞或组织样品：收集细胞或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞 (功率 20％，超声 3s ，间隔 10s，重复 30 次)，10000rpm ，常温离心 10min ，取上清待测。
称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 试剂一进行冰浴匀浆，10000 rpm，常温离心 10min ，取上清待测。
1 、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm ，蒸馏水调零。
2 、标准溶液的制备
将标准品分别稀释为 2.5 、1.25 、0.625 、0.313 、0. 156 、0.078 、0.039μmol/mL 的标准溶液。
3 、在 1 mL 石英比色皿中加入下列试剂：
a.
标准管：在 1 mL 石英比色皿中加入 200μL 标准溶液、800μL 试剂三和 50μL 试剂四混匀，
立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值为 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2 ，计算∆A=A2-A1。
b.
测定管：在 1 mL 石英比色皿中加入 200μL 样本、800μL 试剂三和 50μL 试剂四混匀，立即
记录 340nm 处 20s 时的吸光值为 A1 和 5min20s 时的吸光值 A2 ，计算∆A=A2-A1。
第 1 页 ，共 2 页1 、标准曲线的绘制：
以谷氨酸含量 (µmol/mL) 为 x 轴，标准管∆A 为 y 轴，绘制标准曲线 y=kx+b 。将测定管∆A 带
入方程得到 x 值。
2 、氨基酸含量计算：
(1) 按照蛋白浓度计算
谷氨酸含量 (µmol/mg prot) =x×V 样本÷ (Cpr×V 样本) =x÷Cpr。
(2) 按照样本鲜重计算
谷氨酸含量 (µmol/g 鲜重) =x×V 样本÷ (W÷V 样总×V 样本) =x÷W。
(3) 按照细菌或细胞数量计算
谷氨酸含量 (μmol/10 4 cell) ＝x×V 样本÷ (500÷V 样总×V 样本) =0.002x。
V 样总：加入提取液体积，1mL；V 样本：加入的样本体积，0.2mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；
W：样本鲜重，g；1000：细菌或细胞总数，1000 万。
为提高检测灵敏度，测定管的吸光值应小于 1 且∆A 小于 0.4 ，若大于此值则需要将上清液用试
剂一稀释至适当倍数后测定。
原创作者：上海极威生物科技有限公司
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王小姐
